关键词：医学论文,职称论文发表,围刺电针,乳腺
乳腺增生,又称为乳腺结构不良,是中青年妇女常见的既非炎性又非肿瘤性的增生性乳腺病,临床以乳房肿块和疼痛为主症,与女性内分泌失调有关。近年来临床采用针刺治疗乳腺增生取得了较好的效果,如能结合现代科研手段对有效腧穴、针刺方法进行观察和开展研究,明确其作用机制,则可更好地提高针灸治疗乳腺增生的临床疗效。围刺配合电针治疗乳腺增生系本课题组经多年临床实践筛选出的有效方法,为探讨其具体作用机制,本实验主要观察围刺配合电针对乳腺增生大鼠乳头高度、直径,血清雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progeste-rone,P)、泌乳素(prolactin,PRL)、睾酮(testoste-rone,T)含量和乳腺组织形态、雌激素受体(estro-genreceptor,ER)表达的影响,旨在为临床广泛应用提供理论指导和科学依据。
1材料与方法
1.1实验动物清洁级3月龄Wistar雌性未孕健康大鼠40只,体质量(230±20)g,由河北医科大学动物实验中心提供,合格证号903092。饲养于温度20~26℃、明暗各12h的清洁级动物实验室内,通风良好。自由饮水进食,采用河北医科大学实验动物中心提供的大鼠普通饲料喂养。
1.2实验药物、试剂和仪器己烯雌酚:天津金耀氨基酸有限公司,批号0803281,1mL/0.5mg;黄体酮:天津金耀氨基酸有限公司,批号0802271,1mL/10mg;三苯氧胺(枸橼酸他莫昔芬片):扬子江药业集团有限公司,批号08113001。碘[125I]雌二醇放射免疫分析药盒、碘[125I]孕酮放射免疫分析药盒、碘[125I]泌乳素放射免疫分析药盒、碘[125I]睾酮放射免疫分析药盒,购自天津九鼎医学生物工程有限公司;ER免疫组化检测试剂盒,购于北京中杉金桥生物技术有限公司;ER抗体由SantaCruz公司分装。TDL-5-A型离心机,上海安亭生产;SHB-D循环水真空泵,郑州长城生产;FJ-2021型γ-放射免疫计数器,西安二六二厂生产;0-150mm游标卡尺,台州市航宇工量刃具有限公司生产;2035型LEICA切片机,德国;Ci-tadel-2000包埋机,英国姗顿公司;HMIAS-2000显微图像分析系统,武汉同济医科大学。
1.3分组及造模方法将大鼠随机分为:正常组、模型组、药物组和针刺组,每组10只。根据文献,除正常组外其它3组均于大鼠右下肢外侧肌肉注射己烯雌酚注射液0.5mg/kg,1次/d,连续25d,继于大鼠右下肢外侧肌肉注射黄体酮4mg/kg,1次/d,连续5d,建立大鼠乳腺增生模型。
1.4治疗方法针刺组:将大鼠固定于自制束鼠器上,对第2对左右乳房分别进行围刺,于以乳头为中心,约距乳头3mm为半径圆的3、6、9、12点处,用0.25mm×13mm毫针向乳头方向平刺进针3mm左右,接通G6805-2A型电针仪,采用疏密波,疏波50Hz,密波80Hz,强度为1~2mA(以针柄轻微颤动、大鼠能够耐受、不挣扎撕咬为度),持续刺激30min;同时取“膻中”穴向下15°平刺,进针3mm左右,留针30min。药物组:灌胃三苯氧胺1.8mg/kg(其给药量按文献计算,大致相当于临床等效剂量),将三苯氧胺用蒸馏水配制成0.36mg/mL的混悬液,每只大鼠灌胃量为1~2mL。正常组、模型组、药物组均采用针刺组同法进行抓取固定30min。正常组、模型组、针刺组均采用与药物组同体积的蒸馏水灌胃。4组大鼠的干预措施均为1次/d,连续30d。
1.5取材与检测指标4组大鼠均于治疗前,治疗10、20、30d用精密游标卡尺分别测量第2对左、右乳头高度及直径,取左、右乳头的平均值。4组大鼠均于末次干预措施结束后,禁食不禁水12h,断头采血。血样离心(2000r/min,15min)后取血清,置于-70℃保存,分别按放射免疫测定分析药盒说明书同批检测血清E2、P、PRL、T含量。采用无菌操作取大鼠第2对乳房,用4%的多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,常规H.E.染色,光镜下观察乳腺组织形态表现。运用免疫组化法观察大鼠乳腺组织ER表达情况,操作步骤如下:(1)石蜡切片,常规脱蜡至水;(2)3%H2O2去离子水孵育5~10min,以消除内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗,3min×3次;(3)滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育10~15min,倾去,勿洗;(4)滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2~3h或4℃过夜;(5)PBS冲洗,3min×3次;(6)滴加生物素化二抗工作液,室温或37℃孵育10~15min;(7)PBS冲洗,3min×3次;(8)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温或37℃孵育10~15min;(9)PBS冲洗,3min×3次;(10)显色剂显色(DAB);(11)自来水充分冲洗;(12)封片。于光镜下观察ER阳性表达细胞,并运用HMIAS-2000显微图像分析系统于每一样本随机选取5个视野测量其平均吸光度值(AOD),半定量分析ER的表达。AOD与阳性表达强弱成正比。
1.6统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行统计处理,实验数据均为计量资料,经正态性检验,用均数±标准差(x珚±s)表示。经方差齐性检验,多组之间比较选择单因素方差分析,然后采用SNK检验进行两两比较;对于不同时间点多组间的比较采用重复测量的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义的标准。
2结果
2.1围刺配合电针治疗对乳腺增生大鼠第2对乳头高度、直径的影响见图1、图2。治疗前4组大鼠乳头高度、直径比较,模型组、药物组、针刺组均高于正常组(P<0.05),但3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。直至实验结束,模型组大鼠乳头高度和直径始终明显高于正常组(P<0.05)。治疗10d,针刺组、药物组大鼠乳头高度与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05);治疗10d时针刺组和药物组乳头直径与模型组相比,以及治疗20、30d时两治疗组的乳头高度和直径与模型组相比,均明显减小(P<0.05)。治疗20、30d时,针刺组乳头高度和直径均低于药物组(P<0.05)。
2.2围刺配合电针治疗对乳腺增生大鼠血清E2、P、PRL、T含量的影响见图3-图6。模型组血清E2、PRL、T含量明显高于正常组,血清P含量明显低于正常组(均P<0.05);针刺组和药物组血清E2、PRL、T均低于模型组(P<0.05),血清P含量均高于模型组(P<0.05);针刺组血清E2、PRL、T、P与药物组相比,差异无统计学意义(均P>0.05)。
2.3围刺配合电针治疗对乳腺增生大鼠乳腺组织病理形态的影响光镜下观察,模型组乳腺小叶、腺泡、腺导管数目增多,腺泡腔和腺导管明显扩张,腔内分泌物增多,上皮细胞增生明显,且排列紊乱。针刺组、药物组较模型组明显改善,乳腺小叶、腺泡、腺导管数目减少,腺泡腔及腺导管萎缩,腔内分泌物亦减少,上皮细胞排列趋于规则,与文献报道一致。
2.4围刺配合电针治疗对乳腺增生大鼠ER蛋白表达的影响光镜下观察ER阳性表达细胞,胞核呈黄色或棕黄色。模型组大鼠乳腺组织ER阳性细胞表达明显增多,其AOD明显高于正常组(P<0.05);针刺组和药物组ER阳性细胞表达均低于模型组(P<0.05);针刺组与药物组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图8。
3讨论
现代医学认为乳房是多种内分泌激素的靶器官,造成乳腺增生主要与体内E2绝对或相对增多、长时间的P不足,使乳腺实质增生过度和复旧不全有关。E2、P的共同作用促进乳腺的生长发育,并发动和维持泌乳。T在女性体内主要由卵巢及肾上腺皮质分泌,少量的T可促进乳腺发育,而大量的T则对乳腺发育起抑制作用。ER是一种糖蛋白,具有对E2高选择性、高亲和力、高结合性的生理特点,乳腺组织中ER增加、对E2的敏感性增强是导致乳腺组织增生的重要因素之一。人类乳腺增生的程度参差不齐,常为局限性包块;而大鼠的乳腺增生多为弥漫性,表现为乳房整体增大、乳头增高、乳头直径增大,虽然对大鼠乳房有观察形态、体积、重量等诸多方法,但采用精密游标卡尺重复测量大鼠乳头高度、直径,可直观乳腺增生程度的动态变化。参考大鼠解剖图谱,大鼠第2对乳房与人类乳房的位置最为相近,且便于针刺操作。乳腺增生属中医学“乳癖”范畴。乳癖的发病主要与肝气不舒、冲任失调相关。肝郁犯脾,可致气滞血瘀,津凝成痰,阻于乳络,形成肿块;冲任失和,下可使胞宫经水逆乱,上可使乳房气血凝滞,发为乳癖。治疗应以理气化痰、消瘀散结、调理冲任为法,故拟围刺配合电针治疗乳腺增生,临床效果较佳。本实验针对乳腺增生大鼠所刺之处类似人类肝、胃、脾三经分野,可达疏肝理气、通调乳络、和胃化痰、消瘀散结的目的。膻中为心包络经气聚集之处,是任脉、足太阴、足少阴、手太阳、手少阳经的交会穴,又是宗气聚汇之处,为气会,能宽胸理气,活血通络,消瘀散结,调理冲任。针刺得气后接通电针治疗仪,进一步促进局部气血循环,改善组织营养,消除炎性反应和水肿。本实验与以往实验相比观察角度更加全面具体。结果显示,围刺配合电针治疗对乳腺增生大鼠血清性激素水平紊乱具有一定的调整作用,可以对抗由于雌孕激素水平紊乱造成的大鼠乳头增大,抑制ER与E2的结合,减少雌孕激素水平紊乱对乳腺管的刺激增生作用,促使病理性增生向正常组织转化。
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